OBJETIVOS CIENTÍFICOS
OBJETIVOS 1: Evaluación de la angiogénesis en la enfermedad hepática mediante nanopartículas nóveles y sondas moleculares.
Aunque el papel de la angiogénesis ha sido relacionado con el crecimiento de tumores desde hace décadas, numerosas publicaciones recientes indican que los procesos angiogénicos también contribuyen de manera determinante a la progresión de la enfermedad hepática crónica, la hipertensión portal y sus complicaciones, incluyendo el carcinoma hepatocelular (CHC) (J Hepatol 2009; 50: 604620). La alteración de la angiogénesis en la enfermedad hepática no se circunscribe únicamente al hígado, sino que también se considera un factor crucial en la disfunción de otros órganos, como el pulmón (Hepatology 2018 doi:10.1002/hep.30079):
El presente objetivo desarrollará y utilizará nuevas nanopartículas y sondas moleculares para la evaluación de la angiogénesis en diversos modelos experimentales de enfermedad hepática, con el fin de:
1) Aportar nuevos conocimientos sobre la fisiopatología de la angiogénesis en la enfermedad hepática;
2) Evaluar el potencial de las nuevas herramientas como método de diagnóstico precoz del carcinoma hepatocelular y de la disfunción vascular en la cirrosis;
3) Explorar su uso como herramienta sensible de monitorización de la respuesta a tratamientos antiangiogénicos.
Los subobjetivos específicos del Obj. 1 son:
La detección de procesos angiogénicos en la enfermedad hepática crónica mediante el empleo de trazadores radioactivos derivados del péptido RGD:
Para ello, sintetizaremos y evaluaremos invivo el 68Ga_NOTARGD2, radiotrazador derivado del péptido específico de angiogénesis RGD. El empleo y eficacia de trazadores RGD se ha demostrado ampliamente en Oncología (en roedores y humanos) (Theranostics 2016;6:7892) pero nunca ha sido evaluado en Hepatología. Entre las ventajas de la nueva metodología destacan la mayor sensibilidad de la técnica al portar 2 moléculas del péptido RGD por molécula de radiotrazador, y el empleo de 68Ga, radionúclido fácilmente disponible a partir de generadores portables de 68Ge/68Ga sin necesidad de ciclotrones.
La evaluación de la respuesta a tratamientos antiangiogénicos utilizando los marcadores mencionados en el SubObj.1.1. Para ello, los modelos experimentales serán tratados con medicamentos puramente antiangiogénicos (Bevacizumab) o que combinan acción antiangiogénica con efectos en otras vías de señalización (Sorafenib). La efectividad del tratamiento y la evaluación de dosis y tiempos óptimos de tratamiento se evaluarán de forma no invasiva mediante estudios longitudinales con imagen nuclear PET.
La síntesis y evaluación de nuevas nanopartículas híbridas (MRI, PET) para la detección de procesos angiogénicos: Inicialmente, se llevará a cabo la síntesis de nanoparticulas superparamagnéticas biofuncionalizadas con péptidos RGD y VEGF (específicos de procesos angiogénicos) y marcadas radiactivamente con 68G a , 89Z r o 18F. Tras la optimización sintética y caracterización fisicoquímica de los nuevos sistemas híbridos, éstos serán evaluados in vivo en modelos animales de cirrosis tanto mediante imagen funcional PET como estructural MRI.
OBJETIVO 2: Estudio de la disfunción inmune y del eje intestinohígado en la enfermedad hepática mediante imagen molecular
La disfunción inmune es una característica inherente a la enfermedad hepática crónica (JCI 2017; 127: 5564). Por un lado, la inflamación crónica del hígado es un factor patogénico principal que conduce al desarrollo de fibrosis y cirrosis hepática. Por otro lado, la disfunción hepática origina a su vez disfunción inmune. El eje intestinohígado, con la alteración de la microbiota intestinal y de la permeabilidad de la barrera epitelialvascular intestinal que causa translocación bacteriana, es un factor esencial que perpetúa la relación disfuncional entre el sistema inmune y el hígado en la enfermedad hepática. La disfunción inmune es también un factor relevante en la hipertensión portal y en la mayoría de complicaciones en otros órganos derivadas de la enfermedad hepática.
Entre el amplio rango de alteraciones del sistema inmune en la enfermedad hepática, el presente objetivo se centrará en las alteraciones de los macrófagos y de los neutrófilos. Los macrófagos tisulares hepáticos tienen un reconocido papel en la progresión de la fibrosis, en el daño hepático por alcohol (también conocido como hepatopatía alcohólica o ALD), y en la regeneración hepática. La infiltración hepática por neutrófilos es una característica clásica de la hepatopatía alcohólica. Los subobjetivos específicos que se abordarán son:
Utilidad del radiomarcaje de macrófagos mediante sondas de folato en la enfermedad hepática experimental. Una de las principales características con vistas a la detección de macrófagos activados es su sobreexpresión de receptores folatoβ (FRβ). La bioconjugación de nanopartículas metálicas con moléculas folato o el marcaje directo del ácido fólico o derivados representan una metodología ideal para la detección no invasiva de procesos inflamatorios mediante imagen debido a su elevada afinidad (KD <10−9 M) por dichos FRβ, y a sus propiedades no tóxicas ni inmunogénicas.
Desarrollo de nanopartículas magnéticas para detección mediante imagen por resonancia magnética (MRI) de infiltrado de neutrófilos. Inicialmente, se llevará a cabo la síntesis y caracterización de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro ultrapequeñas (USPIO, ultra small superparagamgentic iron oxide nanoparticles) con un tamaño de núcleo inferior a 10 nm funcionalizadas con polímeros biocompatibles de demostrada no toxicidad tales como polietilenglicol (PEG) o dextrano. A través de su capacidad de fagocitosis se llevará a cabo el marcaje pasivo de neutrófilos.
Evaluación de alteraciones de la barrera epitelialvascular intestinal mediante MRI e inmunohistoquímica empleando nanopartículas de ferritina. Este subobjetivo se llevará a cabo en colaboración con el grupo asociado MAGNETKANT radicado en Rusia. El grupo llevará a cabo la síntesis de nanopartículas magnéticas de diversos tamaños (de 10 a 100 nm) con un “core” de ferritina. El atractivo de estas nanopartículas es que su “core” de ferritina permite su detección tanto por técnicas de imagen (MRI) como por inmunohistoquímica convencional con anticuerpos primarios antiferritina. Estas nanopartículas serán administradas por vía oral y se determinará su presencia en el hígado, con el objeto de identificar alteraciones de la barrera epitelialvascular intestinal. Esto permitirá determinar la relación temporal de estas alteraciones respecto al desarrollo de otras alteraciones de la enfermedad hepática (disbiosis, hipertensión portal, inflamación, fibrosis). Se utilizarán los siguientes modelos experimentales: a) Cirrosis hepática inducida por CCl4 en ratas (ver Obj. 1), y b) Enfermedad hepática por alcohol (ALD) en ratones (ver Obj. 2.1).
OBJETIVO 3: Estudio de las alteraciones metabólicas de la enfermedad hepática crónica y detección precoz del carcinoma hepatocelular mediante trazadores moleculares
El hígado es un órgano central en la homeostasis metabólica de los mamíferos, teniendo un papel relevante en el metabolismo de prácticamente todos los principios inmediatos (hidratos de carbono, aminoácidos y proteínas, grasas, vitaminas y minerales). Aunque la disfunción metabólica es probablemente un fenómeno precoz en la historia natural de la enfermedad hepática, existen mecanismos compensadores tanto en el hígado como en otros órganos que impiden su detección mediante las técnicas y marcadores tradicionalmente utilizados en los hospitales, al menos hasta que la disfunción hepática está muy avanzada. Por otro lado, aunque existe un número creciente de estudios que proponen diversos cribajes metabólicos en sangre para el diagnóstico del carcinoma hepatocelular (HCC), muy pocos de ellos han utilizado trazadores metabólicos para su diagnóstico precoz mediante imagen biomédica.
El presente objetivo se centra en explorar la utilidad de nuevos trazadores moleculares capaces de detectar alteraciones metabólicas con el objeto de
1) Detectar y gradar la repercusión de la enfermedad hepática sobre otros órganos
2) Detectar focos precoces de carciroma hepatocelular (CHC) y colangiocarcinoma (CCA) mediante técnicas de imagen. Para ello, abordaremos los siguientes subobjetivos
Evaluación del metabolismo hepático mediante imagen nuclear PET: Primero, sintetizaremos un trazador PET ácido palmíticoderivado específico del metabolismo oxidativo de ácidos grasos, el ácido [18F]Fluoro6TiaHeptadecanoico (FTHA). Posteriormente, llevaremos a cabo la evaluación de su captación in vivo frente al trazador estándar de metabolismo glucídico 18FDG (18FFluorodeoxiglucosa, trazador estándar de imagen nuclear en clínica).
Desarollo de nanoparticupas superparamagnetica para la detección de carcirnoma hepatocelular (CHC) y del colangiocarcinoma (CCA) mediante imagen por resonancia magnética (MRI). Tras la síntesis de las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro de pequeño tamaño (<10nm), éstas se modificarán con estabilizantes basados en polietilenglicol (PEG) y anticuerpos seleccionados para el diagnóstico del carcinoma hepatocelular (glutamina sintetasa, alfafeto proteína) y del colangiocarcinoma (CA 199, CEA, ErbB2, CK19). El grupo BiiG tiene experiencia en esta tecnología, ya que la ha desarrollado previamente para el cáncer de páncreas en colaboración con la unidad de imagen molecular del CNIO y el grupo de XX IMDEA nanociencia. Este objetivo es especialmente relevante para el CCA, ya que existen notables dificultades diagnósticas en la actualidad. Utilizaremos los modelos murinos de estos tumores descritos previamente, aportados por el grupo asociado LIVERUCM.
OBJETIVO 4: Evaluación y marcaje de exosomas y vesículas extracelulares endógenas y exógenas en la enfermedad hepática.
La comunicación celular mediante exosomas y otras vesículas extracelulares de tamaño nanométrico ha despertado un interés exponencial en la última década, dada su importancia tanto en la homeostasis normal del organismo como en numerosos procesos patológicos, incluyendo el cáncer y la enfermedad hepática. Además, su estructura similar a liposomas artificiales (nanopartículas orgánicas) ha incentivado la evaluación de dichas nanopartículas como plataformas nanométricas naturales de liberación de fármacos y nuevos tratamientos [Tian et al, Biomaterials, 2014]. Las actividades que se proponen en el presente objetivo representan una oportunidad excepcional de crecimiento para los programas EXOHEP-CM y RENIM-CM, recientemente creadas a través de la convocatoria para la realización de actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid en Biomedicina. Brevemente, el programa RENIM-CM persigue el desarrollo de diversas herramientas nanotecnológicas como agentes de imagen en imagen molecular, mientras que el programa EXOHEP-CM persigue el estudio de los exosomas y vesículas extracelulares en la enfermedad hepática desde un abordaje amplio y altamente traslacional (clínicobásico).
El presente objetivo pretende dar respuesta a cuestiones específicas en relación con la reciente colaboración y sinergia investigadora en el campo de los exosomas surgidas entre los miembros de los programas RENIM-CM y EXOHEP-CM.
Los subobjetivos específicos son:
Evaluación de los exosomas obtenidos de la leche de cabra como potencal agente terapéutico en las enfermedades hepáticas. En estudios piloto, el grupo BiiG ha desarrollado técnicas para el marcaje de exosomas derivados de leche de cabra con moléculas fluorescentes y radioactivas para su evaluación como liposomas naturales en diagnóstico no invasivo por imagen molecular, observando una alta captación hepática tras su inyección intravenosa en roedores.
Evaluación de la integridad de la barrera hematoencefálica para el paso de exosomas circulantes en modelos experimentales de encefalopatía hepática. Estudios recientes han demostrado la inducción de inflamación (activación de la microglía) en el cerebro de pacientes y modelos experimentales de encefalopatía hepática, pero la causa de dicha inflamación se desconoce. Algunos estudios sugieren la existencia de alteraciones selectivas en la barrera hematoencefálica. La existencia de una mayor permeabilidad al paso de exosomas circulantes no ha sido explorada aún, pero representa un posible mecanismo para explicar la traslación de la activación inflamatoria sistémica al interior del cerebro.
OBJETIVO 5: Evaluación de muestras de tejidos humanos: Perspectiva traslacional del programa NanoLiver.
Los objetivos propuestos previamente tienen una naturaleza multidisciplinar y se sitúan en la frontera del conocimiento. Aunque dirigidos a la generación y evaluación de herramientas novedosas para procesos fisiopatológicamente relevantes en pacientes con enfermedades hepáticas, los experimentos propuestos tienen un carácter principalmente básicoexperimental. Con el fin de dotar de un mayor carácter traslacional al presente programa, proponemos abordar un objetivo específico en el que explorar la relevancia de los hallazgos encontrados en los objetivos previos (Obj. 1 a Obj. 4) en pacientes con enfermedad hepática. Para ello, proponemos evaluar diversos marcadores de angiogénesis (Integrina avb3, VEGF, VEGFR, CD31), de inflamación (macrófagos [todos]: CD11b y CD68, macrófagos M1: HLADR,
macrófagos M2: CD163, linfocitos T citotóxicos: CD8, linfocitos T reguladores: FoxP3), y de otras poblaciones celulares
hepáticas (hepatocitos: HNF4, células estrelladas activadas: aSMA, colangiocitos: CK19) en muestras de tejido hepático procedente de pacientes. Para ello, utilizaremos 2 técnicas avanzadas de inmunopatología:
1. Histocultivo ex vivo: Consiste en el cultivo de secciones gruesas (250 um) de tejido vivo, permitiendo la realización de estudios de toxicidad, metabolismo, expresión proteíca y biología celular (Oncoimmunology 2017; 6: e1333210).
2. Inmunohistoquímica multiplex. Esta técnica permite la tinción simultánea de hasta 6 antígenos distintos en la misma